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       如果你的蛋白分子量大于150KD，但苦于一直跑不出好看的western-blot，那么這篇文章，你一定得看。

       選對(duì)凝膠很重要
       3種常見(jiàn)的凝膠包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝膠的PH為8.6，且保質(zhì)期很短。在跑膠的過(guò)程中，PH還有上升的趨勢(shì)，可達(dá)到9.5。這會(huì)導(dǎo)致蛋白降解和低分辨率。
       Bis-Tris凝膠的PH為6.4，相對(duì)Tris-Glycine凝膠，穩(wěn)定性和保質(zhì)期都有所增加。但這種凝膠需要在溶液中增加抗氧化劑，比如DTT，以維持蛋白的還原性。
       Tris-Acetate 凝膠的PH為7，跑大分子蛋白會(huì)呈現(xiàn)很高的分辨率。 跑大分子蛋白時(shí)，我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠。

       凝膠濃度很重要
       既然選擇了Tris-Acetate 凝膠，還有幾個(gè)要考慮的問(wèn)題。凝膠濃度與孔徑成反比：濃度越小，孔越大。較大的蛋白質(zhì)容易通過(guò)較大的孔，所以我建議使用低百分比的凝膠，如7％。可以使用梯度凝膠或非梯度凝膠，梯度凝膠適合新樣本。

       提高轉(zhuǎn)移buffer中的SDS，減少甲醇
       轉(zhuǎn)移buffer的組成至關(guān)重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。通過(guò)減少轉(zhuǎn)移buffer中的甲醇百分比（10％或低）來(lái)避免這種情況發(fā)生。 為了進(jìn)一步確保蛋白質(zhì)不會(huì)沉淀，考慮添加SDS至終濃度為0.1％。SDS向蛋白添加均勻的負(fù)電荷，使得它們?nèi)菀讖哪z轉(zhuǎn)移到膜上。

       選擇合適的膜
       膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白選擇PVDF膜。如前面所說(shuō)，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在轉(zhuǎn)移buffer中添加甲醇，目的蛋白轉(zhuǎn)印的機(jī)會(huì)高。兩種類(lèi)型的膜都有各種孔徑尺寸，常見(jiàn)的是0.2um和0.45um。與凝膠一樣，較大的蛋白比較小的容易穿過(guò)大孔隙。大多數(shù)蛋白質(zhì)（> 20kDa）可以用0.45um膜轉(zhuǎn)移，避免使用0.2um孔徑。

       增加轉(zhuǎn)印時(shí)間
       在正確的選擇完凝膠、轉(zhuǎn)印膜及轉(zhuǎn)移buffer后，轉(zhuǎn)印正式開(kāi)始。半干轉(zhuǎn)快且方便，但不適用于大分子蛋白。我建議濕轉(zhuǎn)，因?yàn)榇蠓肿拥鞍邹D(zhuǎn)移時(shí)間很慢，推薦350-400 mA轉(zhuǎn)移90min或 4°C，40 mA，轉(zhuǎn)印過(guò)夜。